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PCR需要注意的一些問題
擴增長目的片段當擴增大于5kb的目的片段時，可以使用用于超長PCR的酶或酶混合物以獲得*產(chǎn)量）。Taq DNA聚合酶并不能有效擴增較長目的片段（大于5kb），可能是因為其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能糾正dNTP錯誤摻入。錯誤配對的延伸幾率大大降低，減少了較長產(chǎn)物的產(chǎn)量。將Taq DNA聚合酶同帶有3'-5'外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶混合，可以擴增zui高為30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（帶有3'-5'外切核酸酶活性）也可以擴增較長產(chǎn)物（≤12kb）。除了選用正確的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，較長產(chǎn)物的擴增還需要改變標準步驟的延伸時間、變性時間、緩沖液pH。按1分鐘/kb增加延伸時間使聚合酶完成合成。一般對于有效的超長PCR，延伸溫度會低至68℃。因為延伸時間較長，對于20kb的模板高達20分鐘，所有使用較高起始pH的緩沖液。如果pH將至低于pH7.0，DNA會脫嘌呤。為了防止模板損傷，在每個循環(huán)將94℃變性時間減少到30秒或更短，將在擴增前溫度增加到94℃變性溫度的時間限制為小于等于1分鐘。引物使用標準方法所使用的同樣的方法設計，使用18到24個堿基得到較好的產(chǎn)量。防止殘余（Carry-over）污染PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源?？梢栽赑CR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用抗氣霧劑移液管的阻止氣霧劑進入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴增后分析設計隔離的區(qū)域，在準備新反應前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。使用預先混合的反應成分，而不是每個反應的每個試劑單獨加入。一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因為前面的擴增產(chǎn)物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物純化殘余反應成分包括抑制克隆，測序和標記反應的引物，核苷和熱穩(wěn)定聚合酶。因此，一般在進一步操作之前需要純化PCR產(chǎn)物。包括多次酚：氯仿抽提及隨后的PEG沉淀或異丙醇沉淀的純化步驟雖然有效，但是耗費時間，且會丟失產(chǎn)物。Maligen Rapid PCR Purification System在10分鐘內(nèi)從反應成分中純化PCR產(chǎn)物。它對80bp到10kb很大范圍的PCR片段都有效，有效回收95％的原有樣品（圖26）。擴增后PCR片段的純化使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含約1μg擴增產(chǎn)物的完整PCR體系。引物36到40堿基長。將峰值反應純化，對純化前（泳道A）和純化后（泳道B）的洗脫液水相使用瓊脂糖凝膠電泳分析。部分PCR產(chǎn)物可能需要通過凝膠電泳，和影響克隆和測序的非特異性PCR產(chǎn)物分離純化出來。使用Maligen Gel Extraction System將目的產(chǎn)物從瓊脂糖中純化出來，這是一種基于硅土的，從凝膠中快速純化DNA片段的技術。